年度別活動報告書：2006年

2．脊索動物と節足動物の共通祖先を理解する

小田広樹（主任研究員） 秋山-小田康子（奨励研究員） 野田彰子（研究補助員） 春田知洋（大阪大学大学院生） 金山真紀（大阪大学大学院生）

2-1 オオヒメグモの尾葉形成と体軸形成の分子メカニズム

はじめに

系統的に遠く離れていると考えられている脊椎動物とショウジョウバエにおいて、相同な遺伝子が個体発生の類似した現象で働いている例が多数見つかっている1)。代表的な例として、前後軸に沿ったパターン形成を制御する遺伝子や背腹軸形成を制御する遺伝子が挙げられる。しかし、このような類似が脊椎動物とハエに見られる理由が、遠い共通祖先の形質を残しているからなのか、異なる起源から偶然に進化したからなのか、脊椎動物と昆虫が実は系統的に近いからなのか、を客観的に判断できるような状況にはない。動物の初期進化の研究が難しい理由は、主に2つの要因からなる。ひとつは、系統関係を推定することの難しさである。最近になって、脊椎動物に最も近い無脊椎動物であると信じられてきたナメクジウオの系統的位置の変更が提案されたことなどからも分かるように2)、3)、最新の分子系統解析法であっても、高次の分類群間の系統関係を解くことは簡単ではない。第二の要因は、動物門という枠組みを超えて形態や発生を比較することの難しさである。例えば、2つの異なる動物種の形を比較するとき、同じ動物門の動物であれば、体の各部位が互いにどう対応するかを判定するのにあまり大きな困難を感じないだろうが、例えば、節足動物門（例えばハエ）と棘皮動物門（例えばヒトデ）の動物であった場合、お互いの体の部位を対応づけることは難しい。「門」という壁を如何に克服するかは進化発生学のひとつの大きな課題となっている。 　門は形態を指標に動物を分類したときに見えてくる枠組みであるが、ゲノムに書き込まれた発生プログラムに基づいて動物を分類することができれば、もう少し別の枠組みが見えてくるかもしれない。現在においてはまだ断片的な知識しかないが、異なる動物門に類似した発生プログラムが見つかる一方、同じ動物門に多様な発生プログラムが存在していることがわかりつつある。それぞれの動物門における保存性と多様性をゲノムの情報に基づいて把握することが、動物の統合的な分類体系を構築することにつながるはずである。そこで私たちは、このような研究の方向性を意図し、ショウジョウバエと同じ節足動物門に属しながら、ショウジョウバエから系統的に遠く離れているオオヒメグモを用いて、ゲノム情報に基づいた比較発生学を展開している。ショウジョウバエにおいて蓄積された知識とオオヒメグモの実験動物としての利点を生かして、節足動物門における保存性や多様性に関する知見を効率良く得ることができると考えている。 　本研究は将来的に動物門を超えて比較することを目標としており、それを可能にするような初期胚発生の現象に重点を置いている。本年度はオオヒメグモの尾部領域の発生を中心に解析を進めた。形態的な側面だけをみても、ハエ胚とクモ胚の後端部の発生様式には大きな違いがあり、この違いを分子レベルで理解することが節足動物の胚発生の多様性を理解する上で重要であると考えた。

結果と考察

（1）デルタ-ノッチシグナルは尾葉形成に必要である

昨年度までの解析により、ショウジョウバエのデルタの相同遺伝子がツイストの中胚葉での発現に10時間ぐらい先行して将来の尾部領域（原口の周り）の表面上皮細胞層で散在的な発現を示し、parental RNAiによってデルタをノックダウンすることによって、尾葉形成に異常が生じることを明らかにした。本年度はさらに詳細な解析を加え、論文にまとめた（現在投稿中4)。ノッチとサプレッサーオブヘアレスの相同遺伝子のノックダウンでもデルタのノックダウンとよく似た表現型が得られた。分子マーカーの発現解析から、デルタ-ノッチシグナルは原口の周りから生じる中胚葉細胞の数を制限し、尾葉の外胚葉を誘導するのに必要であることが示唆された。

（2）尾葉に特異的に発現する遺伝子の探索

図1. マイクロアレイ解析：各種コントロールプローブにおける[At-Delta RNAi胚]と[正常胚]のシグナル強度の比. 　脊椎動物の尾部と節足動物の尾部を比較することを視野に入れて、オオヒメグモの尾葉形成を支配する分子メカニズムの解明を目指した研究をスタートした。正常胚と、尾葉形成に異常が生じるデルタRNAi胚の間の遺伝子発現の差を検出することによって、尾葉に特異的に発現する候補遺伝子を見出すことができるのではないかと考えた。そのために、 EST解析によってこれまでに蓄積してきた配列情報から40merのオリゴDNA配列（プローブ）を12,000種類デザインし、in situ合成方式のマイクロアレイを作製した。そして、尾葉形成期の正常胚と同じステージのデルタRNAi胚からtotal RNAを精製した。異なる蛍光色素で標識した相補的RNA を作製して、競合ハイブリによるマイクロアレイで比較解析を行った。遺伝子発現の差を期待通りに検出できているかどうかを評価するために、コントロールとして9つの遺伝子から21個のプローブ配列をそれぞれ3スポットずつマイクロアレイにあらかじめ組み込んでおいた。コントロール遺伝子のデータから、マイクロアレイで確かにコーダルやオルソデンティクルの発現差を検出できていることがわかった（図1）。そこで、 シグナル強度の比[デルタRNAi胚]/[正常胚]が0.6以下のプローブ配列をポジティブと判定し、42個のクローンを候補として選び、さらにそれらすべてについてin situハイブリダイゼーションを行うことにより、尾葉または中胚葉で特異的に発現するクローンを3つ特定した（図2）。今後はRNAiによりそれらの遺伝子の機能を調べていきたい。 図2. in situハイブリダイゼーションによって尾葉または中胚葉で特異的に発現することが判明した遺伝子クローン. 矢印は尾部領域を指している. 　マイクロアレイ解析に加えて、cDNAサブトラクションによる解析も試みている。尾葉形成期の正常胚からSMART法によりcDNAライブラリーを作製し、それをもとに同じステージのデルタRNAi胚のcDNAを差し引いた。作製したサブトラクションcDNAライブラリーから、1,405個のクローンの5’末端の配列を決定した。これらの配列をクラスタリングしたところ、1,349個のクラスターに分けられた。つまり、重複した配列は非常に少なかった。差し引きの効果というよりも均一化の効果が強く表れたと考えられた。実際に、その1,405個のクローンの中には、発現量が極めて少ないと考えられるコーダルやデカペンタプレジック、フォークヘッドなども含まれていた。当初の意図とは多少異なるが、このライブラリーの解析を進めることで尾葉形成期に発現する遺伝子を網羅的に調べ上げることができると考えている。

（3）オオヒメグモのヘッジホッグとパッチトの初期パターン形成における役割の解析

ショウジョウバエのヘッジホッグとパッチトはセグメントポラリティー遺伝子として知られている5)。ヘッジホッグは分泌タンパク質をコードし、パッチトはその受容体をコードしている。私たちは、オオヒメグモにおいてヘッジホッグとパッチトの相同遺伝子をクローニングし、それらの遺伝子の発現パターンを調べた。ヘッジホッグは最初胚盤のふちで発現し、その後、形成されつつある尾部領域でも発現が始まる。パッチトは胚盤の中心（原口の周り）と胚盤の周縁部で発現している。胚帯期の胚では、ヘッジホッグとパッチトのいずれもショウジョウバエと相同な発現パターンを示した。 図3. パッチトRNAi胚のライブ観察. 胚外領域が胚盤の中心付近にできてしまう（矢印）. 　次に、ヘッジホッグとパッチトの初期胚における機能を調べるためにpRNAiによるノックダウン実験を行った。ヘッジホッグのノックダウンでは、クムルス（体軸形成に重要であることが知られている細胞集団）は正常に胚盤のふちへ移動するものの、その後の胚外領域の誘導や胚盤から胚帯への転換が起こらなかった。一方、パッチトのノックダウンでは、胚盤形成やクムルスの形成は正常に行われているようだが、クムルスの移動が起こらず、本来背側に生じるはずの胚外領域が胚盤の中心領域に誘導された（図3）。これらの結果は、オオヒメグモのヘッジホッグとパッチトが体節形成よりも前に体軸形成に必要とされていることを示唆している。この発見は、ショウジョウバエとオオヒメグモの体軸形成機構の違いを理解する上で重要な鍵を握っているのではないかと私たちは考えており、現在さらに詳細な解析を進めている。

（4）シグナルシーケンス・トラップ法によるオオヒメグモ分泌及び膜タンパク質の探索

オオヒメグモの初期胚発生では、これまで私たちが明らかにしてきたように、ソグやデカペンタプレジック、デルタ、ノッチなど細胞の外で働く分泌因子や膜分子が重要な働きをしている6)、7)。一方、ショウジョウバエでは、転写因子の分布が大きな貢献をしている。この違いは、クモなどの鋏角類の胚発生には調節的な側面が多く見られ、ショウジョウバエの胚発生はモザイク的であることと関係していると思われる。私たちはオオヒメグモ胚で働く分泌因子や膜分子をコードする遺伝子を網羅的に探索するために、酵母を用いたシグナルシーケンス・トラップ法によるスクリーニングを開始した。この方法は、シグナルシーケンス領域を欠いたインベルターゼ突然変異株を、アンチマイシンA存在下、ブドウ糖非存在下（ショ糖存在下）でも生育できるようにレスキューする配列、すなわちインベルターゼのシグナルシーケンスの代替となる配列を探索するものである。オオヒメグモ後期胚由来のcDNAライブラリーのスクリーニングにより、確かに、膜／分泌タンパク質をコードする遺伝子が単離されている。現在、さらにスクリーニングを進めている。

おわりに

これまで私たちの研究はショウジョウバエの知識に依存した形で進めてきたが、本年度の研究で新たな道が開けたと言える。RNAi解析、EST解析、マイクロアレイ解析などを組み合わせることで、他の動物種の知識に頼らずに、オオヒメグモの発生現象に関わる遺伝子を効率よく探索することができるようになった。この方法論を生かして、節足動物の初期胚発生を支配する新しい分子システムを明らかにすることができれば、ショウジョウバエや他の動物との比較を通して、節足動物の祖先的な発生を理解するための手がかりをうることができるであろう。

2-2　カドヘリンの構造と機能の関係の解析

はじめに

多細胞動物は細胞と細胞を連結するために特別な微細構造を持ち、それを巧みに操ることによって体の形を作り上げている。このような細胞間結合構造には何種類かのタイプが知られているが、アドヘレンスジャンクションは多細胞動物に最も普遍的に見られるジャンクションであり、形態形成に最も密接に関わっているジャンクションでもある。アドヘレンスジャンクションにおいて細胞と細胞を繋げている主要な分子はクラシックカドヘリン（以後、カドヘリンと呼ぶ）である。カドヘリンは隣接の細胞に発現する同種のカドヘリンを認識し結合する活性をもつ。私たちはこれまでの研究で、カドヘリンの細胞外領域のドメイン構成は左右相称動物の間で多様であり、その多様性はヒトデやクモで共通に見られる状態からの独立的な短縮化で説明できることを見いだした8）。短縮化されたあるひとつの状態（昆虫型）は、ハエ、コオロギ、トビムシ、アルテミアで見られ、それとは別の状態（脊椎型）が脊椎動物とホヤで、そして、さらに別の状態（頭索型）がナメクジウオで見られる。それぞれの状態は進化的に安定であるが、動物の初期進化のある時点では大きな変化があったと考えられる。私たちは、そのようなカドヘリンの構造変化がカドヘリンの機能にどのような変化をもたらしたのかを実験データに基づいて検証したいと考えている。そこでまず、ジョウジョウバエのカドヘリン（DEカドヘリン）を用いて、昆虫型カドヘリンのドメイン構成がなぜ進化的に安定に保持されているのか、言い換えると、昆虫型カドヘリンの構成要素それぞれが果たす必要不可欠な役割は何かを調べた。とりわけ、脊椎型カドヘリンのドメイン構成との違いに重点を置いて解析を行った。 拡大図を見る 図4. 正常型DEカドヘリンと作製した欠失型DEカドヘリンの模式図 　DEカドヘリンは、細胞外領域に7個のカドヘリンドメイン（EC1-7）と、無脊索ドメイン（NC）、システインリッチEGF様ドメイン（CE）、ラミニングロビュラードメイン（LG）で構成される原始クラシックカドヘリンドメイン（PCCD）複合体を持つ（図4）。昨年度までの解析では、様々なドメインを欠失したDEカドヘリン分子(すべてGFPがタグとして付加されている)を作製し、それらの分子が培養細胞でどれだけの接着活性を示すかを調べた。その結果、EC7とPCCD複合体をともに欠失した分子（DE-EC6と呼ぶ、図4）でも正常分子と同程度の接着活性を示すことが明らかになっていた。そこで本年度は、このDE-EC6が個体内の発生現象においてどれだけの機能を発揮できるかを調べた。

結果と考察

DE-EC6は正常分子と同じようにアドヘレンスジャンクションに局在することができる

UASプロモーターまたはユビキチンプロモーターの制御下でDE-EC6を発現するトランスジェニックショウジョウバエ系統を作出し、胚にDE-EC6を発現させたところ、DE-EC6は正常分子と同じように上皮細胞のアドヘレンスジャンクションに局在した。DEカドヘリンの突然変異体shotgun(shg)のバックグラウンドにDE-EC6を発現させてもアドヘレンスジャンクションに局在した。過去に記述されたPCCD複合体に変異をもつDEカドヘリン分子とは異なって、DE-EC6は生体内の上皮細胞で正常にふるまうことができることがわかった。

DE-EC6は正常分子に近いレベルのトラキア（気管）融合活性をもつ

図5.shg変異体を用いたトラキア融合不全救済実験. 矢印はトラキアが体節間で融合できていないポイントを指している. 　shgヌル変異体では、袋状に陥入したトラキア原基が隣接の体節間で融合しない9)。このshg変異体において、トラキア細胞だけにDE-EC6を発現させてトラキアの融合不全を救済できるかを調べたところ、90%以上の融合ポイント（1個体当たり20ポイント）において完全な救済が認められた（図5）。正常型DEカドヘリン分子では100%に近い融合ポイントで異常が救済されたが、細胞質領域を持たないDEカドヘリン分子やEC2-3に欠失を持つ分子ではそのような救済は全く見られなかった（図5）。これらの結果は、DE-EC6が正常分子に近いレベルのトラキア融合活性をもつことを示した。EC7とPCCD複合体がなくてもDEカドヘリンは生体内である程度の機能を発揮しうることがわかった。

おわりに

EC7とPCCD複合体を欠いたDE-EC6は、培養細胞による集合実験においても、トラキア融合不全救済実験においても、正常分子と同等レベルまたはそれに近いレベルの活性を示した。DE-EC6はDEカドヘリンのすべての機能について正常型DEカドヘリンの肩代わりをできるのであろうか？　それとも、DE-EC6では肩代わりできない機能が存在するのであろうか？　現在、ユビキチンプロモーターの制御下でDE-EC6を発現させてshg変異体の救済実験を行っている。もし正常型カドヘリンでは遂行できるが、DE-EC6では遂行できないような機能を見つけることができれば、無脊索動物に特異的な領域であるPCCD複合体の役割を理解するための助けになるであろう。これらの解析を通して、無脊索動物と脊索動物の上皮細胞の違いを理解することができるのではないかと期待している。

Activity Report

参考文献

1) Carroll, S. B., Grenier, J. K., and Weatherbee, S. D. (2001) From DNA to diversity. Blackwell Science. 2) Oda, H., Wada, H., Tagawa, K., Akiyama-Oda, Y., Satoh, N., Humphreys, T., Zhang, S., and Tsukita, S. (2002) A novel amphioxus cadherin that localizes to epithelial adherens junctions has an unusual domain organization with implications for chordate phylogeny.  Evolution & Development 4, 426-434. 3) Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D. and Philippe, H. (2006). Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates.  Nature 439,965-968. 4) Oda, H., Nishimuta, O., Hirao, Y., Tarui, H., Agata, K. and Akiyama-Oda, Y. (2007). Progressive activation of Delta-Notch signaling from around the blastopore is required to set up a functional caudal lobe in the spider Achaearanea tepidariorum.  submitted. 5) Hooper, J. E. and Scott, M. P. (2005). Communicating with Hedgehogs.  Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6,306-317. 6) Akiyama-Oda, Y. and Oda, H. (2003) Early patterning of the spider embryo: A cluster of mesenchymal cells at the cumulus produces Dpp signals received by germ disc epithelial cells.  Development 130, 1735-1747. 7) Akiyama-Oda, Y. and Oda, H. (2006) Axis specification of the spider embryo: dpp is required for radial-to-axial symmetry transformation and sog for ventral patterning.  Development 133, 2347-2357. 8) Oda, H., Tagawa, K. and Akiyama-Oda, Y. (2005) Diversification of epithelial adherens junctions with independent reductive changes in cadherin form:  identification of potential molecular synapomorphies among bilaterians.  Evol. Dev. 7, 376-389. 9) Uemura, T., Oda, H., Kraut, R., Hayashi, S., Kotaoka, Y. and Takeichi, M. (1996). Zygotic Drosophila E-cadherin expression is required for processes of dynamic epithelial cell rearrangement in the Drosophila embryo.  Genes Dev. 10,659-671.

Cited Reference

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